HPLC verstehen: So wird Reinheit gemessen
Was hinter der Prozentzahl auf dem Analysezertifikat steckt, wie ein Chromatogramm entsteht und warum die Methode genauso wichtig ist wie das Ergebnis.
Die Hochleistungsflüssigkeitschromatographie, kurz HPLC, ist das Standardverfahren, um die Reinheit eines Peptids zu bestimmen. Für Peptide wird fast immer die Umkehrphasen-Variante (RP-HPLC) eingesetzt.
Das Prinzip in drei Sätzen
Die Probe wird in einem Flüssigkeitsstrom durch eine Säule gepumpt, die mit einem unpolaren Material gefüllt ist. Jede Substanz haftet unterschiedlich stark daran und verlässt die Säule deshalb zu einer eigenen Zeit, der Retentionszeit. Ein UV-Detektor am Ausgang misst, wann wie viel Substanz ankommt, typischerweise bei 214 bis 220 nm, wo die Peptidbindung absorbiert.
Das Chromatogramm lesen
Das Ergebnis ist eine Kurve über die Zeit. Jeder Ausschlag (Peak) steht für eine Substanz.
- Hauptpeak: das Zielpeptid
- Nebenpeaks: Verunreinigungen, etwa verkürzte Sequenzen oder Oxidationsprodukte
- Fläche statt Höhe: Gerechnet wird mit der Fläche unter jedem Peak
Die angegebene Reinheit ist der Flächenanteil des Hauptpeaks an allen Peaks. 99,1 % bedeutet also: 99,1 % der bei dieser Wellenlänge sichtbaren Substanz ist das Zielpeptid.
Eine Reinheitsangabe ist nur so aussagekräftig wie die Methode, mit der sie gemessen wurde.
Was die Zahl nicht sagt
Die HPLC-Reinheit ist ein relativer Wert. Sie sagt nichts über den Peptidgehalt (Anteil Peptid am Gesamtgewicht, der durch Wasser und Gegenionen wie Acetat oder TFA unter 100 % liegt) und bestätigt nicht die Identität. Ein falsches Peptid kann ebenfalls als sauberer Einzelpeak erscheinen. Deshalb gehört zu jeder Charge zusätzlich die Massenspektrometrie.
Worauf man bei einem Bericht achten sollte
| Angabe | Warum sie wichtig ist |
|---|---|
| Säule und Gradient | Nur so ist das Ergebnis reproduzierbar |
| Detektionswellenlänge | Bestimmt, welche Verunreinigungen sichtbar werden |
| Chromatogramm als Bild | Die Prozentzahl allein ist nicht überprüfbar |
| Chargennummer | Verknüpft den Bericht mit genau einem Vial |
| Prüflabor und Datum | Macht die Quelle nachvollziehbar |
In unseren Berichten sind diese Angaben für jede Charge offen einsehbar, inklusive interaktivem Chromatogramm.